3T3成纤维细胞ATCC

细胞名称：3T3成纤维细胞ATCC

细胞代次：P4

细胞规格：T25瓶（包邮）/2冷冻管（需加干冰运输费）

细胞冻存：无血清冻存液

细胞传代：第一次建议1:2

细胞收到后处理

培养至良好状态后灌满培养液并封好瓶口是运输细胞的最好办法。收到细胞用75%酒精喷洒整个细胞瓶，消毒后放到超净台内严格无菌操作，将细胞瓶放入37℃、5%CO₂的培养箱中静置3-4小时以稳定细胞状态后再做处理。显微镜观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照保存（最好40x,100x,200x各一张），前三天照片是重要售后依据，不提供照片默认收到状态良好。（注意密封培养瓶放入培养箱时要将盖子拧松，传代后建议一瓶用原瓶的培养基，另外一瓶用自己配的培养基，以便进行对比培养）

培养步骤

细胞传代：如果未超过80%汇合度时，将瓶装的培养液收集至离心管中，留5ml培养基，放入37℃、5%CO₂孵箱培养；如果细胞密度超80%，即可进行传代培养，传代具体步骤如下细胞传代：

A1、对于悬浮细胞，传代可参考以下方法：

方法一：收集细胞，1000RPM条件下离心8-10分钟，弃上清液，补加1-2ml培养液后吹匀，将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或瓶中。

方法二：可选择半数换液方式，弃半数培养基后，将剩余细胞悬起，将细胞悬液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培养基新皿中或者瓶中。

A2、悬浮细胞冻存：

1、细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，将T25 培养瓶中的悬液收集至离心管中1000rpm

离心5min；

2、弃上清，沉淀细胞加入1ml/支的雅吉生物无血清冻存液（C7001），混匀后加入冻存管中。（如：冻一支，加入 1ml 无血清冻存液即可）

3、将冻存细胞直接放入－80℃冰箱即可；如后期要将细胞转入液氮罐中，需在-80℃冰箱存

放 24 小时以上。

B1、对于贴壁细胞，传代可参考如下方法：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2. 添加0.25%消化液约1-2ml至培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上培养基终止消化。

3.轻轻吹打细胞，使之脱落后吸出，然后将悬液转移至15ml离心管中，在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基重悬。

4. 将细胞悬液按1：2的比例进行分瓶传代（两个T25瓶），补充新的培养基至5-8ml/瓶，最后放入到37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养。

B2、贴壁细胞冻存：

1、细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃T25培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；

2、添加0.25%消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入5ml培养液终止消化，再轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心 5min；

3、 弃上清，沉淀细胞加入1ml的雅吉生物无血清冻存液（货号：C7001），混匀后加入冻存管中。

细胞复苏：

1、从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴防护面具），快速将其置入 37℃水浴中解冻， 直至冻存管中无结晶，然后用75%的酒精擦拭冻存管外壁；

2、将冻存管中的细胞移至含 5ml 培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5min；

3、弃上清，沉淀用5ml培养基重悬，接种至T25培养瓶，放于37℃,5%CO₂细胞培养箱中培养；

4、第二天，换用新鲜培养基继续培养。

注意事项：有些细胞比较特殊，如贴壁不牢，在运输过程中发生容易细胞脱落，这是正常现象。请将培养瓶所有培养液收集至离心管，1000rpm离心5min，收集上清作过渡培养（后期对比培养），沉淀加入消化液1-2ml，轻轻吹打，重悬，消化1-2分钟后，加5ml培养基终止反应。再离心，弃上清，加1-2ml培养基重悬。然后按1:2比例进行分瓶传代（两个T25），补充新的培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃,5%CO₂细胞培养箱中培养。

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